Contichrom? CUBE層析系統(tǒng)可采用批處理和連續(xù)周期逆流（PCC）進(jìn)行目標(biāo)蛋白親和層析純化。PCC可使捕獲環(huán)節(jié)層析填料的利用率顯著提高，其與傳統(tǒng)批處理相比，可普遍提高40% - 60%。此外，還可使產(chǎn)量提高2倍。該系統(tǒng)具有更快的處理速度，可縮短目標(biāo)蛋白在上樣過程中與蛋白酶和糖苷酶的接觸時間，從而保護蛋白完整性。簡化的雙柱位配置，最大限度地降低了硬件故障風(fēng)險。2C-PCC (CaptureSMB?)是最簡化和最有效的PCC設(shè)計。
本應(yīng)用手冊介紹了Contichrom? CUBE FPLC系統(tǒng)CaptureSMB?動態(tài)過程控制——AutomAb?如何在層析填料結(jié)合載量發(fā)生變化的情況下進(jìn)行調(diào)整。層析填料結(jié)合載量的變化，是由于填料在使用過程中的損耗或上樣蛋白濃度不同、成分改變等造成的。該動態(tài)控制是與FDA所提倡的通過過程分析技術(shù)（PAT）提高產(chǎn)品質(zhì)量相一致的。

產(chǎn)品介紹

連續(xù)流層析可獲得更高的產(chǎn)量，且成本更低，這是通過降低Protein A 填料用量和緩沖液消耗量實現(xiàn)的。由于操作穩(wěn)定，其可更好地保證產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。為保證連續(xù)工藝處于最佳設(shè)定點，需要進(jìn)行動態(tài)過程控制。PCC工藝的高產(chǎn)量可使投入降低，設(shè)備占地面積更小，卻可提供與更大規(guī)格的普通設(shè)備相同的產(chǎn)出。

2C-PCC (CaptureSMB?)基礎(chǔ)理論

2C-PCC 僅用2根層析柱即可實現(xiàn)循環(huán)化捕獲純化過程（圖1），這是最簡化和最穩(wěn)定的多柱捕獲過程，并已被科學(xué)證實，這比其它多柱配置更為有效。* 2C-PCC采用優(yōu)化的子過程進(jìn)行上樣、淋洗、在位清洗和再生，2根層析柱恰當(dāng)連接或獨立運行。親和填料價格昂貴，通過優(yōu)化上樣工藝，可使親和填料達(dá)到完全滿載，利用率達(dá)到最高。

圖1. ?2C-PCC (CaptureSMBa)原理

步驟?1：在連續(xù)上樣階段，柱1和柱2保持串聯(lián)。柱1滿載樣品（紅色），其流穿被柱2捕獲。

步驟?2：柱1進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時柱2進(jìn)行連續(xù)上樣。

步驟?3： 柱1再生完畢后，將層析柱進(jìn)行串聯(lián)，柱2滿載后，其流穿被柱1捕獲。

步驟?4：柱2進(jìn)行洗脫、清洗和再平衡，同時柱1進(jìn)行連續(xù)上樣。該連續(xù)處理方法循環(huán)進(jìn)行。


圖2.普通層析和PCC載量利用率對比圖。圖A為批處理上樣。在批處理的捕獲過程中，當(dāng)樣品出現(xiàn)流穿時，上樣必須結(jié)束，從而避免樣品損失。圖B：在2C-PCC連續(xù)上樣階段，第1根層析柱進(jìn)行上樣，直至出現(xiàn)流穿（例如70%流穿），流穿樣品被第2根層析柱捕獲。因此，第1根層析柱的載量利用率得到顯著提高。

Contichrom? CUBE系統(tǒng)進(jìn)行2C-PCC

Contichrom? CUBE系統(tǒng)可進(jìn)行目標(biāo)分子的連續(xù)純化。其建立雙柱位Contichrom?平臺旨在簡化系統(tǒng)配置和操作處理。其捕獲過程動態(tài)控制功能AutomAb?是Contichrom? CUBE的關(guān)鍵功能。雙柱位設(shè)計不僅更可靠，而且比普通批處理和其它多柱位設(shè)計效率更高（圖3）。


圖3.載量利用率> 90%的多柱位系統(tǒng)產(chǎn)量對比圖。其顯示了典型上樣濃度2.5 g/L和5 g/L的影響結(jié)果。2C-PCC比普通批處理和更復(fù)雜的3柱位、4柱位設(shè)計更具優(yōu)勢。*

動態(tài)過程控制原理

Contichrom? CUBE層析系統(tǒng)采用獨特的過程控制程序——AutomAb?自動糾正過程中的偏差，從而使其保持在設(shè)定點。AutomAb?可以監(jiān)測并控制層析柱的飽和水平，且可以自動進(jìn)行調(diào)整。如果工藝參數(shù)發(fā)生變化，比如樣品成分的變化（包括目標(biāo)蛋白質(zhì)量或濃度的變化）或?qū)游鎏盍陷d量的變化，上樣時間也會進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。層析填料的載量會由于親和配基的脫落而發(fā)生變化，例如用于mAb純化的Protein A。

該系統(tǒng)也可運行固化的過程控制，即運行預(yù)先設(shè)定的固定層析過程控制。無論該過程引入任何變化，都會被排斥掉，這將導(dǎo)致獲得的目標(biāo)產(chǎn)品的濃度和質(zhì)量發(fā)生改變。因此，當(dāng)進(jìn)行連續(xù)工藝生產(chǎn)時，動態(tài)過程控制必不可少。

*參考文獻(xiàn): Baur D., Angarita M., Müller-Sp?th T., Steinebach F., Morbidelli M. 2016. Comparison of batch and continuous multi-column protein A capture processes by optimal design. Biotechnology Journal. 11: 1860-7314.

AutomAb? 控制的定義

AutomAb? 是一種保證捕獲過程處于最優(yōu)的控制工具，即使在過程參數(shù)發(fā)生變化時也不例外。當(dāng)2根層析柱串聯(lián)后上樣，第2根層析柱可以接收第1根層析柱的流穿(預(yù)上樣) 。AutomAb? 可以通過控制相關(guān)聯(lián)的上樣時間來保證預(yù)上樣面積恒定，從而保證在連續(xù)上樣過程中，上樣至下一根層析柱的樣品量保持相同。預(yù)上樣面積可由使用者自行確定，也可由AutomAb?在第1次循環(huán)中計算得到。

其它的動態(tài)過程控制系統(tǒng)是通過測定柱前、柱后的UV 信號相對值來進(jìn)行判斷的，這需要1套額外的檢測器。然而AutomAb?僅需要1套UV檢測器位于2根層析柱之間即可（圖4）。因此，AutomAb? 消除了由于UV檢測器校準(zhǔn)偏差所造成的錯誤風(fēng)險。

圖4. 2C-PCC系統(tǒng)的每根層析柱都有其專屬的UV檢測器位于柱后。層析柱連接后，第1根層析柱的流出端UV信號，也同樣是第2根層析柱的流入端UV信號（見上圖UV1）。AutomAb? 監(jiān)測第1根層析柱的流出端UV信號并保證mAb持續(xù)上至第2根層析柱。

AutomAb? 控制操作

2C-PCC進(jìn)行多次循環(huán)操作后，層析柱載量會同單柱位捕獲一樣降低，例如填料的protein A配基密度降低導(dǎo)致。該影響通常可在重復(fù)清洗/淋洗以及堿處理后觀察到。其結(jié)果是，導(dǎo)致預(yù)上樣面積值縮小。同樣，蛋白濃度會隨時間增長或降低（例如灌流細(xì)胞培養(yǎng)），從而導(dǎo)致預(yù)上樣到達(dá)時間提前或延遲。無論預(yù)上樣與之前的循環(huán)相比提前還是延遲，AutomAb?可以通過自動調(diào)整上樣時間來保證預(yù)上樣面積恒定。因此，填料利用率和抗體回收率仍然保持在最優(yōu)水平。該控制系統(tǒng)還可以消除柱效差異所導(dǎo)致的不同流穿曲線形狀影響（圖5）。


圖5. AutomAb?控制的2C-PCC 圖譜。柱效差異所導(dǎo)致的流穿曲線形狀（紅線：柱1；藍(lán)線：柱2）并不影響預(yù)上樣。

增加控制的靈活性

與其它多柱位PCC相比，其連續(xù)上樣與回收、再生的執(zhí)行是完全獨立的，這避免了限速步驟（如長時間CIP）與連續(xù)上樣并行進(jìn)行。因此，AutomAb?可徹底控制連續(xù)上樣時間。這保證連續(xù)上樣步驟在不同上樣濃度和載量降低的情況下，仍可在最大流速下進(jìn)行。

2C-PCC設(shè)計與 AutomAb?

使用CaptureSMB? 向?qū)В梢酝ㄟ^單次流穿曲線數(shù)據(jù)得到2C-PCC 運行方法（見圖6）。該方法可顯示最優(yōu)的2C-PCC操作要點，該向?qū)Э娠@示預(yù)期的運行狀態(tài)，例如產(chǎn)量、載量利用率、緩沖液和樣品消耗量、產(chǎn)品濃度以及運行時間。可在向?qū)е羞x擇AutomAb?控制，當(dāng)運行啟動時該選擇即被激發(fā)，此后，AutomAb?即可保持最優(yōu)控制點。

圖6. CaptureSMB 向?qū)煞椒鞒虉D。AutomAb?控制為可選項。

結(jié) 論

毫無疑問，連續(xù)流層析可顯著提高下游純化的產(chǎn)量。然而。若沒有動態(tài)過程控制，則需要設(shè)定額外的安全范圍來避免洗脫產(chǎn)物發(fā)生變化，這將導(dǎo)致工藝缺乏可靠性或造成產(chǎn)品損失。

AutomAb?動態(tài)控制功能可保證2C-PCC實現(xiàn)最優(yōu)操作。在各種情況下，例如樣品濃度或?qū)游鎏盍陷d量的變化，都是可以得到補償?shù)摹utomAb? 確保連續(xù)流層析可用于處理存在上樣成分變化的 灌流細(xì)胞培養(yǎng)。